研究人员通过确定石墨烯能量转移轴向位置 可实现显着更高分辨率
2023-05-18 10:30:16   来源： ()　   评论：0 点击：

  在三维纳米显微镜的常用技术中，并不完全丰富的光子分裂并有助于目标分子的横向或轴向定位。如果使用石墨烯能量转移来确定轴向位置，则可以实现更高的分辨率。

　　显然，没有什么能阻止纳米显微镜发明家们朝着远远超出 Ernst Abbe 的 200 纳米极限的分辨率迈进。这并不总是需要一种值得诺贝尔奖的全新设备——他们的技巧现在已经很丰富了，研究人员只需组合不同的工具就可以实现改进或克服现有问题。

　　由慕尼黑大学的 Philip Tinnefeld 领导的团队提供了这方面的证据。它开发了一种过程，可以精确地观察纳米世界的三维视图。为此，该小组将超分辨率显微镜技术 p-MINFLUX 和 DNA-PAINT 与所谓的石墨烯能量转移相结合。通过这三种方法的相互作用，单个分子可以在 xy 平面上以大约 2 纳米的精度和在 z 轴

  以 0.3 纳米的精度定位。

但首先，让我们回到几年前。2016 年，由 Francisco Balzarotti 和 Stefan Hell 领导的研究人员展示了一种具有“最小光子通量”的超分辨率共聚焦显微镜，他们将其命名为 MINFLUX。与 Hell 的 STED 显微镜类似，MINFLUX 显微镜将环形激光束投射到样品上。命中的荧光团在光束较亮的外环中亮起，但在甜甜圈的中心没有显示荧光，那里的激发光最弱。激光扫描样品并记录信号。如果光束瞄准荧光团，软件将校正对准，直到荧光最小。在这一点上，可以用纳米精度确定分子的定位。事实上，为了计算二维定位的坐标，用三个合适的激光位置记录荧光团的强度就足够了。

　　“但我们没有与 MINFLUX 合作，而是与 p-MINFLUX 合作，”当前出版物的第一作者和 Tinnefeld 小组的博士生 Jonas Zähringer 补充道。P 代表 Pulsed Interleaved：与 MINFLUX 相比，激光使用短光脉冲激发荧光团（Nano Lett. 21(1): 840-46）。剧透警报：当与石墨烯能量转移相结合时，这个微小但至关重要的差异将变得更加重要！

　　延时激光脉冲

　　p-MINFLUX 不是移动单个激光直到出现来自荧光团的信号，而是使用四个激光，其中圆环瞄准一个位置。每个激光器一个接一个地发射激光脉冲，在每个激光脉冲之后，对荧光团的信号进行评估。“脉冲在时间上偏移了大约 12 纳秒，”Zähringer 解释说。“因为我们确切地知道每个激光器何时处于活动状态以及它被分配到哪个甜甜圈位置，所以我们可以在不移动甜甜圈的情况下确定荧光团的位置。”

　　Zähringer 继续说道，激光也可用于三维分辨率，但随后必须使用更多光子进行激发。因此，该团队仅使用 p-MINFLUX 来确定 xy 坐标。该小组还使用了一个技巧来记录 z 轴上的确切位置。为此，她将样品放在覆盖有碳改性石墨烯的盖玻片上。激发的荧光团将能量转移到石墨烯——能量转移的强度取决于荧光团和石墨烯之间的距离。

　　能量转移越强，荧光寿命越短，对测量具有决定性意义。因为该小组没有使用恒定的激发光，而是使用激光脉冲，所以他们可以测量这次。“我们几乎免费获得这些信息，”Zähringer 解释说。

　　当荧光团接受激发激光的能量时，它会在释放光子之前保持激发态几皮秒到纳秒。激发态的持续时间因情况而异，但可以平均预测。Zähringer 说：“如果你重复激发几次，并得到一百个光子的直方图，你就可以找出荧光寿命。”

　　双用光子

　　荧光团到石墨烯盖玻片的距离越小，荧光寿命越短。结合 p-MINFLUX，协同使用每个光子：传感器捕获的光子提供了荧光团在 xy 平面中的位置信息。激发和发射之间的平均持续时间包含有关 z 轴位置的空间信息。

　　能量转移到石墨烯不仅会缩短荧光寿命，还会降低荧光团的亮度。这种所谓的猝灭越强，荧光团和石墨烯盖玻片之间的距离越短。“百分之一的寿命，强度也只有百分之一，”Zähringer 在解释联轴器时说。因为淬火几乎是 100% 直接作用于样品表面，所以这也具有破坏性、非特异性效应被“沉默”的优点。“所以我们对此类破坏性事件不敏感，”Zähringer 说。

　　然而，超分辨率光学显微镜并不总是精确定位单个荧光分子——即使分辨率低至纳米，令人印象深刻。“你想要测量其距离的两个荧光团也可以靠得很近。在这种情况下，你只会得到一个所谓的质量中心，”博士生解释道。换句话说，当两个可以自行定位的分子靠近在一起时，只能看到一个模糊的点。可以确定亮度中心，但无法区分两个荧光团。“仅使用 MINFLUX，您最初无法测量距离，”Zähringer 证实。

　　但是这个问题也可以通过超分辨率技巧盒中的工具来解决：“通常，您使用合适的化学物质来产生随机闪烁并在更长的时间内进行测量。在相邻荧光团的情况下，有时一个点亮，有时另一个点亮。这为您提供了有关它们距离的信息。” PALM 和 dSTORM 是基于该技术的最著名的超分辨率显微镜方法。

　　然而，当荧光团靠得很近时，就会发生能量转移。虽然两个分子中只有一个被光子激发，但它可以将能量传递给相邻的分子。“然后我们就不能再单独激活这些荧光团了。此外，能量转移会导致更强的光漂白，”Zähringer 说。当然，这取决于你想在显微镜下观察什么。如果由单个荧光团标记的结构相距很远，则没有问题。然而，在一个非常密集的环境中，相邻荧光团之间的距离甚至无法通过随机闪烁来解决。

　　“相反，你必须确保只有一个荧光团同时出现在同一个地方。我们通过 DNA-PAINT 技术确保这一点，”Zähringer 强调说。DNA-PAINT 基于互补碱基的可逆配对。为此，从特异性结合样品中蛋白质的核酸产生适体。然而，适体不包含荧光团。相反，染料附着在可在培养基中自由移动并与适体杂交的 DNA 序列上。这种所谓的成像器只能偶尔在目标分子上找到，这期间可以精确定位。合适浓度的成像器可确保荧光团不会同时出现在两个相邻的目标分子上。

　　除了适体，还可以使用一种抗体，该抗体附着有与成像序列互补的短 DNA 序列。本质上，在 DNA-PAINT 的情况下，PALM 或 dSTORM 中荧光团的随机闪烁被荧光团与目标分子的暂时结合所取代。

　　系留成像仪

　　如果要在更短的时间内记录样本，则需要更高的成像器浓度。然而，由于自由扩散的荧光团，信号和背景之间的比率也会恶化。因此，该团队提出了 DNA-PAINT 的修改版本。在这种情况下，用荧光团标记的 DNA 除了成像基序外，还包含一个所谓的集中器，它可以更长时间甚至永久地结合到目标区域。成像器序列通过链接器挂在集中器的（或多或少）线上，可以扫描环境。如果它找到一个互补目标，它就会与其结合，但也会再次脱离它——而集中器始终将成像器保持在附近。它不是在高浓度下使用成像器，而是仅在局部进行富集。

　　Zähringer 确认 p-MINFLUX、石墨烯能量转移和 DNA-PAINT 的组合最初旨在作为概念验证。因此，该小组没有使用天然生物样本来测试该技术，而是使用 DNA 折纸制作的结构。然而，原则上，该方法特别适用于溶解密集的局部簇 - 并且原则上也与活细胞成像兼容。

　　Zähringer 显然已经对此有了具体的想法，但现在还不想透露太多。